Az első munkatervet nem sikerült megvalósítani, mivel számos probléma merült fel az A.c.-AChBP/nAChRICD kimérák tisztításával. Stabil sejtvonalakat hoztak létre különböző A.c.-AChBP/nAChRICD konstrukciókhoz. Mindegyik tartalmazott egy N-terminális FLAG-jelölést, amelyet affinitástisztításhoz használtak. A nagyléptékű tisztítás gyenge expressziót és a fehérje aggregációját eredményezte. Ezért az erőfeszítések a nagyléptékű tisztítás optimalizálására összpontosultak.

A tisztítási termékek denaturáló gélen történő futtatása egyértelműen további, FLAG-szekvenciát nem tartalmazó sávokat mutat, Amikor azonban a Western blotot túltelítettük, hogy még a leghalványabb sávokat is azonosítsuk, több sávot is azonosítottunk, amelyek olyan fehérjét tartalmaztak, amely veszélyezteti a FLAG szekvenciát. Az ígéretesnek tűnő kezdeti tranziens transzfekciók és a létrehozott stabil sejtvonalak közötti sávok eltértek, különösen az Ac-α4ICD/β2ICD esetében, de elvileg minden fő sáv látható volt a minták között, még ha intenzitásuk eltérő is volt. Úgy döntöttek, hogy a stabil sejtvonalban található ismeretlen kiemelkedő sávot az Ac-α7ICD-vel azonosítják, abban a reményben, hogy az már az α7-nAChR intracelluláris doménkötője. Egy friss tételt küldtek szekvenciaelemzésre, és az erős kötőanyagot végül szarvasmarha szérumalbuminként azonosították. Ez sajnos azt jelentette, hogy mivel a fehérjét egy HEK293S Gnt1 sejtvonal választja ki, amely glutaminnal és 10% magzati szarvasmarha-szérummal kiegészített Dulbecco-féle módosított Eagle táptalajon növekszik, az aggregáció és az asszociáció nem az emberi sejtvonalon belüli valamilyen endogén fehérjéből származik, hanem az extracelluláris táptalajból. Két módszert próbáltak ki az aggregáció kezelésére, amelyről feltételezték, hogy kölcsönhatás miatt következik be. a használt extracelluláris közeggel. Az ICD számos cisztein aminosavat tartalmaz, ezért az első módszer azt feltételezte, hogy ha redukáljuk a már felhajtott és tisztított fehérjét, akkor ez visszanyerheti a megfelelően felhajtott pentamert. A tisztított fehérje FPLC-elemzése a redukált fehérjéhez képest nem mutatott jelentős változást a profilban. A második lehetőség a sejtvonalak újraalkotása volt szérummentes HEK293F Freestyle sejtekben, abban a reményben, hogy a szérumalbumin hiánya megakadályozhatja a tisztítás után megfigyelt aggregációt. Ezeket a szuszpenziós sejteket adaptálták a szérummentes közegben való boldoguláshoz. Tranziens transzfekciókat végeztek, és affinitástisztítást végeztek gélelektroforézissel, Western blottal és méretkizárásos kromatográfiával. Egyik sem adott jó eredményt. A denaturált minták gélje két sávot mutatott, de egyiket sem detektálták Western-kromatográfiával, ami a HEK293Freestyle sejtek által kiválasztott expresszió hiányát és/vagy valamilyen szennyező fehérjét jelezne, mivel maga a közeg elméletileg fehérjementes. A tömegspektrometriás szekvenálás eredményei nem voltak egyértelműek, mivel a β2-nAChR ICD-fragmenseit azonosították a ~60 kDa-os sávban, de a konstrukció elméleti molekulatömegének 40,7 kDa, és a méretkizárásos kromatográfia a monomerhez hasonló retenciós időt mutatott.
Mivel a tranziens transzfekciók nem eredményeztek stabil pentamert vagy tiszta eredményt, a HEK293GnT1- sejtekben létező stabil sejtvonalat megpróbálták adaptálni a szérummentes táptalajhoz. Ezt kétféleképpen hajtották végre: közvetlen cserével, amelyben a sejtek látszólag tolerálták az első passzázst az elpusztulás előtt, és lassú, egyenletes cserével a teljes DMEM-ről ¾-től ½-ig, ¼-ig és végül a teljesen szérummentes táptalajra. Mivel a sejtek nem tolerálták az ¼ DMEM-et, és végül a teljes szérummentes táptalajban is elpusztultak, úgy döntöttek, hogy több lemezt passzálnak át, és alaposan lemossák őket, mielőtt a táptalajt szérummentes táptalajra cserélnék, hogy 150 ml-t gyűjtsenek össze egy mini-tételes tisztításhoz, mielőtt a sejtek elpusztulnának. Ez a kísérlet szerencsére sikeres volt, eltávolította az aggregációt, és nagyobb csúcsokat adott, mint egy ~20 kDa-os fehérje. Sajnos nem egyetlen stabil pentamer fehérjét eredményezett, hanem a fehérje számos csonkolt formáját (amelyeket a Western azonosított), valamint a tranziens transzfekciókban látható két sávot (ismét nem...). (a nyugati fél által jelenlévő) és egy másik ismeretlen sávot vizualizáltak a minta elemzésével. Sajnos ekkorra a további tömegspektrometriás elemzésre rendelkezésre álló források kimerültek, és a projektgazda megtagadta a források átcsoportosítását az ismeretlen sáv meghatározására. Az FPLC elemzés azt mutatta, hogy a konstrukció nem képez stabil pentamereket, és az autoproteolízis problémás lehet a monomer formában történő alkalmazásában.
Bár ígéretesnek tűnt a projekt időbeli és finanszírozási korlátai miatt, a stabil pentamer hiánya számos próbálkozás után is az 1. munkaterv sikeres megvalósítására irányuló további kísérletek elvetését eredményezte. A konstrukció intracelluláris domén kölcsönhatásba lépő partnerek keresésének eszközeként való használata ezen a ponton problematikusnak tűnik, és a konstrukció másik lehetséges fontossága (az ICD szerkezetének meghatározására való felhasználása) semmissé vált az α7-nAChR TMD/ICD NMR-szerkezetének (Bondarenko, V. et al. Nat. Commun. 2022) a projekt során történő közzétételével.

A második munkatervet részben sikerült megvalósítani, mivel specifikus VHH nanotesteket hoztak létre, bár az ICD-kötésre gyakorolt ​​sztöchiometrikus hatás értékelése nem volt lehetséges. Különböző mutánsokat generáltak az extracelluláris konstrukciókhoz. Az α7-A.c.-AChBP konstrukció kezdeti utánzatai az α4/α4- és α4/β2- esetében vagy nem expresszálódtak, vagy aggregálódtak. Ezért a mutációk csökkentésével próbálták megtalálni az expresszáló hely legjobb jellemzését. Az expressziós teszt viszonylag egyszerű volt, de a megfelelő feltekeredés ellenőrzése munkaigényes és időigényes volt, mivel minden konstrukcióhoz mini tisztításra volt szükség. Az alacsony expressziós szintek azt is jelentették, hogy egyes konstrukcióknál ismétlésekre volt szükség. Ez jelentősen lelassította a folyamatot, mivel egy adott mutáns eredményei kulcsfontosságúak voltak a további mutációk eldöntésében. A kezdeti konstrukciók közül csak néhány α4/α4 konstrukció expresszálódott, amelyek közül három aggregálódott, egy pedig monomerként expresszálódott. Ezért több α4/α4- és α4/β2-A.c.-AChBP-t hoztak létre, abban a reményben, hogy megtalálják a β2-ben a megfelelő aminosavakat, amelyek kizárják ennek a kimérának az expresszióját. Az α4/α4-konstrukciók közül csak kettő expresszálódott. A WP1 késedelmei miatt az erőfeszítések egy olyan mutáns előállítására összpontosultak, amely jobban megfelel az emberi α4/α4-interfésznek, mivel a jól expresszáló kezdeti konstrukciók nagyon kevés mutációt tartalmaztak. Ekkor a kutatásvezető egy másik projekthez kapott források felhasználásával korszerűsítette a projekthez vásárolt kromatográfiás berendezéseket, ami lehetővé tette a fluoreszcencia egyidejű detektálását a kromatográfiás futtatás során. A mutánsok kiértékelésének nagyon időigényes folyamata és az újonnan elérhető frissítés miatt egy C-terminális GFP-vel kapcsolt A.c.-AChBP-Y55W konstrukciót hoztak létre, hogy megkerüljék a kis tételű tisztítások szükségességét, és bizonyos esetekben a stabil sejtvonalak létrehozását ezen tisztítások eléréséhez. Ez a konstrukció könnyen kimutatható volt fluoreszcens méretkizárásos kromatográfiával 100 μl 10 ml-es táptalajmintából a 3. napon egy tranziens transzfekció után. Bár ez azt jelentette, hogy néhány ilyen C-terminális kötéssel rendelkező konstrukciót újra kellett létrehozni, a mutánsok ellenőrzése később sokkal egyszerűbb és hatékonyabb volt. Végül találtak egy olyan α4/α4-A.c.-AChBP konstrukciót, amely majdnem ugyanannyi felszíni mutációt expresszál és tartalmaz, mint a publikált α7-A.c.-AChBP (Nemecz et al. 2011). Az időbeli korlátok miatt ezeket a konstrukciókat nem lehetett a VHH könyvtárral szemben szűrni a projekt időkorlátján belül. Mivel a tervezett A.c.-AChBP kimérák (α4/α4, α4/β2, α7/α7, α7/β2) minden egyes kombinációjának előállítása nehézségekbe ütközött, az alegység-interfész konstrukciók mellett úgy döntöttek, hogy olyan konstrukciókat hoznak létre, amelyek utánozzák az egyes alegységek fő immunogén régióját, másodlagos lehetőségként bizonyos altípusok elleni specifikus VHH-k izolálására. Ezért négy további mutánst hoztak létre, amelyek a korábban publikált α7-A.c.-AChBP konstrukcióra épültek. Szerencsére ezek a konstrukciók első próbálkozásra teljes mutációval expresszálódtak. A kiterjesztett α7-A.c.-AChBP konstrukciót a VHH könyvtárral szemben szűrték, de az időbeli korlátok miatt az apikális α4-A.c.-AChBP és az apikális β2-A.c.-AChBP konstrukciókat nem szűrték.
Mivel a WP2a-ban is voltak késedelmek, a WP2b-t előrehozták, és a VHH-könyvtár létrehozását korábban kezdték meg. Bár az elméleti diverzitás alacsony volt, a már létrehozott α7-A.c.-AChBP-vel szemben elvégezték a szkrínelést. Sajnos a szkrínelés során nem találtak találatot. A további finanszírozásra irányuló sikeres pályázattal olyan berendezéseket vásároltak, amelyek lehetővé tették a kezdeti könyvtár diverzitásának növelését a cDNA-könyvtár bakteriális sejtekbe történő hatékonyabb transzformálásával. További időbe telt egy jobb szintetikus fágmegjelenítésű VHH könyvtár újra létrehozása, de végül megérte, és 5,4x1011 elméleti diverzitást értek el. Annak biztosítása érdekében, hogy a projekt legalább néhány, az eredeti célokhoz kapcsolódó eredményt kapjon, az α4/α4-A.c.-AChBP konstrukciók létrehozása és tesztelése során az új VHH könyvtárat teljes hosszúságú, HEK293 sejtekben expresszált α4β2-nAChR-ekkel szemben szűrték, emellett megismételték a szűrést a kiterjesztett α7-A.c.-AChBP mutánssal szemben is. A kiterjesztett α7-A.c.-AChBP elleni szűrések pozitív VHH-kat eredményeztek, de nem voltak szelektívek a mutánsra a vad típusú A.c.-AChBP-vel szemben. Az α4β2-nAChR-t expresszáló sejtek elleni szűrés sikeres volt, és olyan VHH-kat találtak, amelyek szelektívek voltak a receptor expresszió nélküli HEK293 sejtekkel szemben. A finanszírozás hiánya miatt a hangsúly az α4β2-nAChR VHH-k szekvenálására és jellemzésére irányult abban a reményben, hogy közülük valamelyik szelektívnek bizonyulhat vagy az α4α4-interfészre, vagy csak az α4-nAChR alegységre, vagy fordítva, a β2β2-interfészre vagy csak a β2-nAChR alegységre. További kísérletekre van szükség a VHH-k igazolásához, mielőtt publikációt lehetne benyújtani, és sajnos ez kívül esik a jelenlegi projekt keretein. A szükséges felszerelést egy másik, a POLS projekthez nem kapcsolódó projekt finanszírozásából szerezték be, és ez a berendezés felhasználható a VHH megfelelő jellemzésére vonatkozó követelmények teljesítésére.
A funkcionális jellemzés folytatódik, de a projekt befejezési határideje és a 2024. június 30-i elfogadott publikációs határidő miatt a VHH-k pentamer ligandummal szabályozott ioncsatornákkal szembeni hatásáról szóló áttekintő cikket nyújtottak be a projekt követelményeinek teljesítése érdekében, ahelyett, hogy kockáztatták volna, hogy a VHH-k publikációját nem fogadják el 2024. június 30-ig. Végső soron ez egy második publikált cikket eredményez, mivel az áttekintő cikket nem számolták bele a tervezett publikációkba.