Pierwszy plan pracy nie został zrealizowany, ponieważ pojawiło się wiele problemów z oczyszczaniem chimer A.c.-AChBP/nAChRICD. Wygenerowano stabilne linie komórkowe dla różnych konstruktów A.c.-AChBP/nAChRICD. Wszystkie zawierały znacznik FLAG na końcu N, używany do oczyszczania powinowactwa. Oczyszczanie na dużą skalę wykazało słabą ekspresję i agregację białka. Dlatego skoncentrowano wysiłki na optymalizacji oczyszczania na dużą skalę.

Przepuszczenie produktów oczyszczania na żelu denaturującym wyraźnie pokazuje dodatkowe prążki, które nie zawierają sekwencji FLAG, ale po przesyceniu western blot, w celu zidentyfikowania nawet najsłabszych prążków, zidentyfikowano wiele prążków zawierających białko, które narusza sekwencję FLAG. Prążki między początkowymi, obiecującymi, przejściowymi transfekcjami a wygenerowanymi stabilnymi liniami komórkowymi różniły się, szczególnie w przypadku Ac-α4ICD/β2ICD, ale zasadniczo wszystkie główne prążki były widoczne między próbkami, nawet jeśli ich intensywność była różna. Postanowiono zidentyfikować nieznany, wyraźny prążek w stabilnej linii komórkowej z Ac-α7ICD, mając nadzieję, że jest on już wewnątrzkomórkowym łącznikiem domeny α7-nAChR. Świeżą partię wysłano do analizy sekwencyjnej, a silny łącznik ostatecznie zidentyfikowano jako albuminę surowicy bydlęcej. Niestety oznaczało to, że ponieważ białko jest wydzielane z linii komórkowej HEK293S Gnt1, która rośnie w podłożu Dulbecco’s Modified Eagle Medium, uzupełnionym glutaminą i 10% płodową surowicą bydlęcą, agregacja i asocjacja nie pochodzą z jakiegoś endogennego białka w linii komórkowej człowieka, ale raczej z podłoża zewnątrzkomórkowego. Wypróbowano dwie metody rozwiązania problemu agregacji, która, jak przypuszczano, występuje w wyniku interakcji z stosowanym podłożem zewnątrzkomórkowym. ICD zawiera wiele reszt cysteiny, dlatego pierwsza metoda zakładała, że ​​jeśli zredukujemy już sfałdowane i oczyszczone białko, możemy odzyskać prawidłowo sfałdowany pentamer. Analiza FPLC oczyszczonego białka w porównaniu z białkiem zredukowanym nie wykazała znaczącej zmiany w profilu. Drugą opcją było odtworzenie linii komórkowych w komórkach HEK293F Freestyle bez surowicy, z nadzieją, że brak albuminy surowicy pozwoli uniknąć agregacji obserwowanej po oczyszczeniu. Te komórki w zawiesinie zostały przystosowane do rozwoju w podłożu bez surowicy. Przeprowadzono transfekcje przejściowe i oczyszczono metodą powinowactwa z weryfikacją za pomocą elektroforezy żelowej, western blot i chromatografii wykluczania molekularnego. Żadna z tych metod nie dała dobrych rezultatów. Żel zdenaturowanych próbek wykazał dwa pasma, ale żadnego z nich nie wykryto metodą western, co wskazywałoby na brak ekspresji i/lub wydzielanie białka zanieczyszczającego z komórek HEK293Freestyle, ponieważ samo medium jest teoretycznie wolne od białka. Wyniki sekwencjonowania spektrometrii mas nie były jednoznaczne, ponieważ fragmenty ICD β2-nAChR zostały zidentyfikowane w paśmie ~60 kDa, ale teoretyczna masa cząsteczkowa konstruktu powinna wynosić 40,7 kDa, a chromatografia wykluczania molekularnego wykazała czas retencji podobny do monomeru. Ponieważ transfekcje przejściowe nie doprowadziły do ​​uzyskania stabilnego pentameru ani jednoznacznego wyniku, podjęto próbę adaptacji stabilnej linii komórkowej występującej w komórkach HEK293GnT1 do medium bez surowicy. Przeprowadzono to zarówno poprzez wymianę bezpośrednią, w której komórki zdawały się tolerować pierwsze pasażowanie przed obumarciem, jak i powolną, stabilną wymianę, przechodzącą z pełnego DMEM do ¾, ½, ¼ i ostatecznie do pożywki całkowicie bez surowicy. Ponieważ komórki nie tolerowały ¼ DMEM i ostatecznie obumierały w pożywce całkowicie bez surowicy, zdecydowano się na pasażowanie kilku płytek i dokładne ich płukanie przed wymianą pożywki na pożywkę bez surowicy, aby pobrać 150 ml do oczyszczania w minipartiach, zanim komórki obumrą. Ta próba zakończyła się sukcesem, usuwając agregację i dając większe piki niż białko o masie cząsteczkowej ~20 kDa. Niestety, nie udało się uzyskać ani jednego stabilnego białka pentamerycznego. Analiza próbki ujawniła wiele skróconych form białka (zidentyfikowanych przez Western), wraz z dwoma pasmami widocznymi w transfekcjach przejściowych (również nieobecnymi przez Western) oraz jednym innym, nieznanym pasmem. Niestety, w tym momencie wyczerpały się fundusze na dalsze analizy metodą spektrometrii mas, a promotor projektu odmówił ich ponownego przydzielenia w celu określenia nieznanego pasma. Analiza FPLC wykazała, że ​​konstrukt nie tworzy stabilnych pentamerów i że autoproteoliza może okazać się problematyczna w jego zastosowaniu, nawet w formie monomerycznej.
Chociaż projekt był obiecujący, ze względu na ograniczenia czasowe i finansowe, brak stabilnego pentamera po wielu próbach doprowadził do zaniechania dalszych prób realizacji planu prac nr 1. Wykorzystanie tego konstruktu jako narzędzia do poszukiwania partnerów oddziałujących z domenami wewnątrzkomórkowymi wydaje się na tym etapie problematyczne, a inne potencjalne znaczenie tego konstruktu (jego wykorzystanie do określenia struktury ICD) zostało zniweczone wraz z opublikowaniem struktury NMR α7-nAChR TMD/ICD (Bondarenko, V. i in. Nat. Commun. 2022) w trakcie tego projektu.

Drugi plan pracy został częściowo zrealizowany, ponieważ stworzono specyficzne nanociała VHH, chociaż nie można było ocenić wpływu stechiometrycznego na wiązanie ICD. Wygenerowano różne mutanty dla konstruktów zewnątrzkomórkowych. Początkowe imitacje konstruktu α7-A.c.-AChBP dla α4/α4- i α4/β2- nie ulegały ekspresji lub ulegały agregacji. Dlatego też dokonano redukcji mutacji, aby znaleźć najlepszą charakterystykę miejsca, w którym zachodzi ekspresja. Test ekspresji był stosunkowo łatwy, ale weryfikacja prawidłowego fałdowania była pracochłonna i czasochłonna, ponieważ wymagana była mini-oczyszczanie każdego konstruktu. Niski poziom ekspresji oznaczał również, że dla niektórych konstruktów konieczne były powtórzenia. To znacznie spowolniło postęp, ponieważ wyniki danego mutanta były kluczowe dla podjęcia decyzji o dalszych mutacjach. Spośród początkowych konstruktów, tylko niektóre z konstruktów α4/α4 uległy ekspresji, z czego trzy uległy agregacji, a jeden ekspresji jako monomer. Dlatego stworzono więcej α4/α4- i α4/β2-A.c.-AChBP, mając nadzieję na znalezienie odpowiednich reszt w β2, które uniemożliwiają ekspresję tej chimery. Ekspresja wystąpiła tylko w dwóch z konstruktów α4/α4. Z powodu opóźnień w WP1, skoncentrowano wysiłki na wytworzeniu mutanta, który byłby bardziej zgodny z ludzkim interfejsem α4/α4, ponieważ początkowe konstrukty, które dobrze się wyrażały, miały bardzo niewiele mutacji. W tym czasie PI zmodernizował zakupiony sprzęt chromatograficzny na potrzeby tego projektu, wykorzystując fundusze uzyskane z innego projektu, co umożliwiło jednoczesną detekcję fluorescencji podczas przebiegu chromatografii. Ze względu na bardzo czasochłonny proces oceny mutantów oraz nowo dostępną modernizację, stworzono konstrukt A.c.-AChBP-Y55W połączony z C-końcowym GFP, aby ominąć konieczność oczyszczania małych partii, a w niektórych przypadkach tworzenia stabilnych linii w celu osiągnięcia tych oczyszczeń. Konstrukt ten był łatwo wykrywalny metodą fluorescencyjnej chromatografii wykluczania molekularnego w 100 μl 10 ml próbki pożywki w 3. dniu po przejściowej transfeccji. Chociaż oznaczało to konieczność odtworzenia kilku konstruktów z takim połączeniem C-końcowym, późniejsza weryfikacja mutantów była znacznie prostsza i skuteczniejsza. Ostatecznie znaleziono konstrukt dla α4/α4-A.c.-AChBP, który ekspresjonuje i zawiera niemal taką samą liczbę mutacji powierzchniowych, jak opublikowany α7-A.c.-AChBP (Nemecz i in. 2011). Ze względu na ograniczenia czasowe konstrukty te nie mogły zostać przebadane pod kątem biblioteki VHH w ramach projektu. Ze względu na trudności w uzyskaniu każdej kombinacji planowanych chimer A.c.-AChBP (α4/α4, α4/β2, α7/α7, α7/β2), oprócz konstrukcji interfejsu podjednostek, zdecydowano się na stworzenie konstrukcji naśladujących główny region immunogenny każdej podjednostki, jako drugorzędną opcję izolacji specyficznych VHH przeciwko określonym podtypom. W związku z tym stworzono cztery dodatkowe mutanty, bazujące na wcześniej opublikowanym konstrukcie α7-A.c.-AChBP. Na szczęście te konstrukty zostały wyrażone z pełną mutacją już za pierwszym razem. Rozszerzony konstrukt α7-A.c.-AChBP został przebadany pod kątem biblioteki VHH, ale ze względu na ograniczenia czasowe nie przebadano apikalnych konstruktów α4-A.c.-AChBP i β2-A.c.-AChBP.
Zdając sobie sprawę z opóźnień w WP2a, WP2b został przeniesiony wyżej, a generowanie biblioteki VHH rozpoczęto wcześniej. Pomimo niskiej różnorodności teoretycznej, przeprowadzono skanowanie z wykorzystaniem już utworzonego α7-A.c.-AChBP. Niestety, podczas skanowania nie znaleziono żadnego trafienia. Dzięki pozytywnemu rozpatrzeniu wniosku o dodatkowe finansowanie zakupiono sprzęt, który pozwolił na zwiększenie różnorodności tej początkowej biblioteki poprzez wydajniejszą transformację biblioteki cDNA do komórek bakteryjnych. Odtworzenie lepszej syntetycznej biblioteki VHH do prezentacji fagowej zajęło trochę czasu, ale ostatecznie się opłaciło i uzyskano teoretyczną różnorodność na poziomie 5,4x1011. Aby upewnić się, że projekt uzyska przynajmniej niektóre wyniki istotne dla pierwotnych celów, podczas tworzenia i testowania konstrukcji α4/α4-A.c.-AChBP, nową bibliotekę VHH przebadano pod kątem pełnej długości receptorów α4β2-nAChR ekspresjonowanych w komórkach HEK293, a także powtórzono badanie przesiewowe pod kątem wydłużonego mutanta α7-A.c.-AChBP. Badania przesiewowe pod kątem wydłużonego α7-A.c.-AChBP dały pozytywne wyniki VHH, ale nie były one selektywne dla mutanta w porównaniu z dzikim typem A.c.-AChBP. Badanie przesiewowe pod kątem komórek ekspresjonujących α4β2-nAChR zakończyło się sukcesem i znaleziono VHH, które były selektywne na tle komórek HEK293 bez ekspresji receptora. Z powodu braku funduszy skoncentrowano się na sekwencjonowaniu i charakteryzowaniu VHH receptora α4β2-nAChR w nadziei, że któryś z nich okaże się selektywny albo dla interfejsu α4α4, albo tylko dla samej podjednostki α4-nAChR, albo odwrotnie – dla interfejsu β2β2 lub tylko dla samej podjednostki β2-nAChR. Przed złożeniem publikacji konieczne są dalsze eksperymenty w celu weryfikacji VHH, co niestety wykracza poza zakres obecnego projektu. Potrzebny sprzęt pozyskano w wyniku uzyskania dofinansowania na inny projekt niezwiązany z projektem POLS i może on zostać wykorzystany do spełnienia wymagań prawidłowej charakterystyki VHH.
Charakterystyka funkcjonalna jest kontynuowana, ale ze względu na termin zakończenia projektu i 30 czerwca 2024 r. jako termin akceptacji publikacji, złożono artykuł przeglądowy na temat VHH przeciwko pentamerowym kanałom jonowym bramkowanym ligandem, aby spełnić wymagania tego projektu, zamiast ryzykować, że publikacja VHH nie zostanie zaakceptowana do 30 czerwca 2024 r. Ostatecznie doprowadzi to do faktycznego opublikowania drugiego artykułu, ponieważ przegląd nie został uwzględniony w planowanych publikacjach.